有害藻华（HABs）监测/预警的新解决方案
内容提供：泽泉生态开放实验室
1 背景
伴随着我国经济快速发展的同时，生态环境持续恶化。近年来我国水体中有害藻华（Harmful Algal Blooms，HABs）（包括海洋赤潮和淡水水华）持续高频次发生，已严重影响到居民的饮水安全、水产养殖、水体景观价值等方面，造成了巨大的经济损失。我国各级政府部门和科研机构对水体中浮游植物群落的动态变化进行快速监测、对淡水蓝藻水华和海洋硅藻/甲藻赤潮进行早期预警的需求越来越强烈。
目前我国浮游植物和有害藻华的监测主要采用显微计数、叶绿素含量测定、卫星遥感等技术。显微计数采集的样品需要经过鲁格氏液、甲醛等固定液固定，带回实验室沉淀浓缩后进行定性定量分析，需要花费的时间较长。此外，显微镜下藻类分类和计数需要非常专业的人员，且分析样品的效率较低（一般而言，对一个样品同时进行定性定量分析约需2 h）。叶绿素含量测定是一种相对较快速简单的测量技术，但传统的测量方法多为现场抽滤后带回实验室抽提，然后进行分光光度计分析、荧光分光光度计分析或高效液相色普（HPLC）分析，但这种技术最快也需要1－2天才能获得结果。这两种方法均不能立即反映出水体中的藻类信息，而是要经过一段分析时间，从而降低了生物监测的时效性，大大影响有害藻华的监测/预警。此外，叶绿素含量测定也可用原位传感器进行连续监测，但这种方法多采用若丹明法（化学法）校正数据，误差大，且传感器需要经常维护。卫星遥感具备监测范围广、数据多、不受地理位置和人为条件限制等优点，但其容易受天气条件影响，且往往需要藻类细胞累积到一定程度（可能已经发生藻华）才能监测到，往往达不到预警的效果，而且购买卫星遥感数据费用高，分析复杂，因此卫星遥感多在专业机构进行。
为配合国内相关科研和监测单位进行有害藻华的快速现场监测并进行早期预警，泽泉生态开放实验室推出“有害藻华（HABs）监测/预警的新解决方案”。
2 有害藻华（HABs）监测/预警的新解决方案
2.1 监测功能：
1） 利用浮游植物荧光仪PHYTO-PAM现场测量蓝藻、绿藻、硅/甲藻的叶绿素a含量和总叶绿素a含量，以及它们的光合活性（“生长潜能”）
2） 利用便携式浮游植物流式细胞仪CytoSense或水下浮游植物流式细胞仪CytoSub对浮游植物细胞数进行快速计数，并获知主要类群的细胞浓度、细胞大小、细胞形态学信息；获知微囊藻、棕囊藻等的群体（囊）动力学变化情况；对于链状藻类，可以测量每条链的细胞数；对于硅藻、甲藻等形状特殊的藻类，可根据浮游植物专家库鉴定到种
3） 利用在线监测型浮游植物流式细胞仪CytoBuoy对水体中的浮游植物进行长期连续监测
2.2 预警功能：
1） 根据叶绿素a含量和细胞数变化趋势进行预警
2） 浮游植物的光合活性（“生长潜能”）预示着未来的生长潜力，光合活性高、耐强光的浮游植物在环境条件（营养盐、光照、温度）适合时更容易发生藻华，
3） 微囊藻、棕囊藻等带囊的藻类，不形成囊不发生藻华，而利用CytoSense等可长期监测水体中微囊藻、棕囊藻等“囊”的变化，进行早期预警
2.3 所需设备及用途：
1） 浮游植物荧光仪PHYTO-PAM
* 现场快速对水样中的蓝藻、绿藻、硅/甲藻自动定性（分类）定量（测叶绿素a）
* 现场快速测量蓝藻、绿藻、硅/甲藻的光合活性（“生长潜能”）
2） CytoBuoy系列浮游植物流式细胞仪（CytoSense、CytoBuoy、CytoSub）
* 现场快速计数水体中浮游植物细胞总数
* 现场快速获取浮游植物细胞类群信息（浓度、大小、类群、定种）
* 现场快速测量微囊藻、棕囊藻等细胞数以及“囊”的比例
3 浮游植物荧光仪技术原理及仪器介绍
3.1 利用叶绿素荧光测量叶绿素a含量的原理
浮游植物细胞中的叶绿素分子吸收的光能，一部分用于进行光合作用，一部分以热的形式耗散到环境中，剩余的部分以荧光的形式发射出来。活体叶绿素荧光的强度与细胞吸收的光强有关，但在很弱的光强下，叶绿素荧光强度只与叶绿素含量的高低有关。因此可通过测量特定光强下（仪器控制）浮游植物细胞发出的叶绿素荧光强度来测量叶绿素a含量。
3.2 利用PHYTO-PAM对浮游植物分类的原理
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蓝藻、绿藻、硅藻/甲藻往往是水体中的优势种。蓝藻的主要捕光色素是藻胆蛋白，偏好吸收橙红色光（645 nm）；绿藻的主要捕光色素是叶绿素a和b，偏好吸收蓝光（470 nm）和红光（665 nm）；硅藻和甲藻的色素相同，都是类胡萝卜素和叶绿素c，偏好吸收绿光（520 nm）。PHYTO-PAM利用蓝色（470 nm）、绿色（520 nm）、浅红色（645 nm）和深红色（665 nm）的发光二极管（LED）给出微秒级的测量光脉冲。不同颜色的测量光脉冲在高频率下交替应用，就可以获得4种波长的光激发出的半同步的荧光信号。结合纯种藻类的参考光谱（Reference spectrum）就可对蓝藻、绿藻、硅/甲藻进行分类（定性），进而分别测量它们的叶绿素a含量和光合活性。由于硅藻和甲藻的色素组成差别不大，目前技术上还很难对它们进行区分。
3.3 利用PHYTO-PAM测量光合作用的原理
如 3.1所述，（活体细胞中）叶绿素吸收的光分三条通路：光合作用（P）、热耗散（D）和荧光（F）。根据能量守恒，P＋D＋F＝1。PHYTO-PAM可以直接检测荧光强度，还可提供一个超强饱和闪光（1 s内）使光合作用暂时被抑制，由此可知热耗散的量，进一步可知光合作用活性。这项技术已成为目前最方便、快捷的检测植物光合作用的方法，其发明人 Schreiber教授因此获得首届国际光合作用协会创新大奖。
PHYTO-PAM可以测量的光合作用参数包括：
* Fv/Fm，浮游植物的潜在最大光合效率（“生长潜能”）
* Y，给定光强下浮游植物的实际光合效率
* ETR，给定光强下浮游植物的实际光合速率
* ETRmax，浮游植物的潜在最大光合速率
* a，浮游植物对光强的利用能力
* Ik，浮游植物耐受强光的能力
* 快速光曲线，结合水体光场可用于计算水体初级生产力
3.4 利用浮游植物光合活性进行水华预警的原理
藻类的生长靠光合作用，藻华的爆发是在特定的环境条件下（富营养、高光、高温）由藻类短期快速暴增造成的，这其间藻类必须具备极强的光合作用才能快速生长。监测叶绿素a含量可以了解目前水体中的藻类生物量，但这只代表历史（如果营养盐很低，即使当前藻类生物量高，也不具备发生藻华的可能）；而监测藻类的光合作用活性可以了解藻类的“生长潜能”，结合其它环境条件可以预测未来（富营养条件且高光高温下，即使当前藻类生物量不高，但只要光合作用活性强，就具有极大的发生藻华的可能）。由于PHYTO-PAM可以测量自然水样中蓝藻、绿藻和硅/甲藻各自的光合作用，就可以对藻华发生时不同藻类类群进行分析。利用PHYTO-PAM测量不同藻类叶绿素a含量和光合作用活性的功能，可以长期监测自然水体中浮游植物种群生物量的动力学变化和不同类群光合作用潜力的变化趋势，这对于藻华的预警具有重要参考价值。
3.5 浮游植物荧光仪PHYTO-PAM的主要功能
?* 全世界第一台可对浮游植物自动分类的调制叶绿素荧光仪
?* 可对蓝藻、绿藻和硅/甲藻自动分类（定性）
?* 可自动测量水样中蓝藻、绿藻和硅/甲藻的叶绿素a含量和总叶绿素a含量（定量）
?* 可同时测量水样中蓝藻、绿藻和硅/甲藻的光合作用活性
?* 可测量光合作用的光合效率和电子传递速率
?* 可自动记录光合效率和电子传递速率的快速光响应曲线
?* 用户可做自己的参考光谱
?* 专业PhytoWin操作软件，数据收集、分析和存贮功能强大
?* 用户可利用培养的微藻做参考光谱，非“黑匣子”
?* 可在野外测量后根据水体藻类组成利用优势种（一种或多种）的参考光谱校对实验结果
4 浮游植物流式细胞仪技术原理及仪器介绍
4.1 利用流式细胞仪进行浮游植物细胞计数的原理
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流式细胞仪的基本原理：根据流体动力学原理让液体中的颗粒（包括细胞）逐一通过激光束（检测区），激光照射到颗粒上会引起光的散射，如果颗粒（如藻细胞）含有色素还可以发出荧光，这些散射光和荧光被检测器收集后转换成电信号存储下来，并利用软件进行自动分析。水中的浮游植物细胞做为一个个颗粒，当然可以进行流式细胞计数。
一台功能强大的流式细胞仪可以检测浮游植物细胞的前向光散射（FWC）、侧向光散射（SWC）和多色荧光。这些信号除了用于进行细胞计数外，还包含如下信息：前向光散射反映了细胞的大小；侧向光散射反映了细胞的形状；多色荧光则反映了细胞含有哪些色素。这些信息结合起来可以对不同类型的细胞进行聚类（聚群）分析。
4.2 传统流式细胞仪进行浮游植物细胞计数的缺陷
传统的商用流式细胞仪都是为生物医学研究设计的，用于免疫学、分子生物学、细胞生物学等领域，尽管也有人用于浮游植物研究，但由于以下缺点难以进行有害藻华监测和预警：
* 仪器沉重、无法在野外使用
* 每次测量需要复杂的校准，每次开机需要校准，仪器移动后需要校准
* 必须专人管理，使用人员必须经过长期培训
* 测量粒径范围小，一般为0.4微米至几十个微米，多数浮游植物细胞超过了其监测范围
* 测量浓度范围小，一般为105－106个细胞/升，样品过浓需要稀释，样品过稀需要浓缩
* 样品必须经过严格的预处理（过滤、分级等）才可测量
* 无法直接测量微囊藻、棕囊藻等群体样品，需要预先打碎群体
* 需要外加鞘液，用量大
* 维护成本高
4.3 浮游植物流式细胞仪的主要特性
CytoBuoy系列浮游植物流式细胞仪是专为浮游植物研究设计的流式细胞仪，适用于野外现场测量，充分考虑到了藻类样品的复杂性和仪器的便携性、抗震性。
* 全球唯一专为浮游植物研究设计的流式细胞仪
* 仪器便携、防震、防抖、耐冲击、防水或防溅水
* 操作简单，不需复杂的校准，不需专人管理
* 测量粒径范围大，覆盖几乎所有的浮游植物粒径范围：1－4000 mm（标准版）或0.4－4000 mm（pico-版）
* 测量浓度范围大，达102－1010个细胞/升
* 样品不需预处理即可直接测量
* 利用GV模块可直接测量带气囊的藻（微囊藻、棕囊藻）
* 不需外加鞘液，利用样品过滤液做为循环鞘液
* 可获取每个细胞所有检测信号的扫描图谱，每个图谱可获得9个拓扑学指标，内含丰富的形态学信息
* 可建立浮游植物专家库，对硅藻、甲藻等形态特殊的种类鉴定到种
* 可升级增加成像功能，拍摄特定细胞的照片
4.4 浮游植物流式细胞仪的应用模式
CytoBuoy系列浮游植物流式细胞仪有三种型号：
* 便携式浮游植物流式细胞仪CytoSense
* 在线监测型浮游植物流式细胞仪CytoBuoy
* 水下浮游植物流式细胞仪CytoSub
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CytoSense属于便携式仪器，可在室内、野外、船上（包括小艇）使用。
CytoBuoy用于定点长期监测，数据可远程无线传输。
CytoSub可用于水下剖面测量或AUV搭载巡航测量，可自容式测量，可在线测量。
根据需要，CytoSense可升级为CytoBuoy或CytoSub。
4.5 浮游植物流式细胞仪测量微囊藻的方法
有些浮游植物（如微囊藻）带有气囊。气囊会改变光散射，从而会改变这类浮游植物的“光学指纹”。通过GV模块施加瞬间高压可以打破气囊，从而消除由于气囊引起的光散射变化，修复“光学指纹”。通过两次测量可以方便的区分出带气囊的种：第一次直接测量，第二次施加高压破坏气囊后测量。那些在施加高压后改变了光散射的种就是带气囊的种。
微囊藻、棕囊藻等带囊的藻类，不形成囊不发生藻华，而利用CytoSense等可长期监测水体中微囊藻、棕囊藻等“囊”的变化，进行早期预警。
4.6 浮游植物流式细胞仪鉴定到种的方法
当细胞颗粒在流动池中通过检测区域时，CytoBuoy系列流式细胞仪可以扫描记录各种光学信号（散射、荧光）的动态变化（扫描图谱，全球唯一），这些信号包涵了丰富的细胞形态学信息，利用这些形态学信息可以建立浮游植物特征信息专家数据库，进而利用CytoBuoy进行浮游植物的详细分类，有助于了解浮游植物的种群变化和水华预警。
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每个细胞的扫描图谱包含了丰富的形态学信息
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这些形态学信息可用于建立浮游植物专家库
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软件根据扫描图谱，可以获知链状细胞的具体细胞数目
4.7 浮游植物流式细胞仪应用于高浊度水体的对策
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1）进样筛选
水样被进样器采集后，在进样器内部经过筛选排除空气和砂粒。进样器内部设计独特，从上到下有三个出水口，其中上边的出水口用于排除空气，而多数砂粒由于沉降速率较大会经下部出水口排除，只有中间的出水口用于采集浮游植物、浮游动物和与它们密度相差不大的砂粒进行流式细胞计数和其它分析。如果水中砂粒粒径很大，可以在进样器中增加一个不锈钢筛网，用于滤除粒径大于1 mm的泥沙颗粒。对于多数粒径大于50-100 mm的砂粒而言，它们的沉降速率大于CytoSense的进样流速（1-2 cm/s），因此不会被进样器吸入。
2）外置鞘液系统
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5 有害藻华监测/预警展望
综上所述，浮游植物荧光仪PHYTO-PAM和CytoBuoy系列浮游植物流式细胞仪在有害藻华的监测/预警方面具有非常大的应用潜力，前者重在自动分类的基础上同时了解生物量和光合活性（“生长潜能”），后者重在专门针对浮游植物的细胞计数，且可直接测量微囊藻，对形状特殊的藻可鉴定到种。两种技术都是目前国际上最前沿的技术，且仪器都是为野外应用而设计，充分考虑到了现场监测的困难。两种技术可分别用于有害藻华的监测/预警，如果结合使用，对于监测/预警的效果会更好。相信两种技术对于我们淡水与海洋环境的有害藻华监测/预警都会发挥极大的助力作用。
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